Como funciona a Produção in vitro de embriões bovinos (PIVE)?

A produção in vitro de embriões (PIVE) como ferramenta valiosa para a melhoria da eficiência reprodutiva e genética do rebanho

Quais as etapas da produção in vitro de embriões?

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotécnica reprodutiva considerada uma ferramenta valiosa para a melhoria da eficiência reprodutiva e também da genética do rebanho. 

Ela permite recolher OÓCITOS de uma fêmea (doadora), manipula-lo em laboratório para maturarem, serem fecundados e desenvolverem em embriões para então transferi-los para fêmeas (receptoras) com a finalidade de completarem o período de gestação.

Nesse artigo iremos abordar o passo a passo das etapas necessárias para a produção in vitro de embriões bovinos, incluindo desde a coleta dos oócitos até a criopreservação ou transferência para o animal receptor e também trataremos sobre as principais vantagens da utilização dessa biotecnologia reprodutiva. 

Entendendo a fisiologia para então entendermos a técnica

Para que seja possível realizar a produção de embriões in vitro, uma série de passos complexos e especializados são envolvidos, entretanto, podemos resumir o processo da seguinte maneira:

• Doadora 🡪 Aspiração folicular (oócitos imaturos) 🡪 Maturação (metáfise II) 🡪 Fecundação 🡪  Desnudação do zigoto 🡪  Cultivo in vitro por 7 dias (desenvolvimento – primeiras clivagens: mórula – blastócito)  🡪 Transferência para a receptora previamente sincronizada ou congelamento.

Quando se trata desse assunto, é importante lembrar que todo o processo que ocorre em laboratório tem a intenção de simular o que de fato acontece fisiologicamente no animal. Por isso, é essencial entendermos o ciclo estral da vaca e também sobre as ondas de crescimento folicular: 

• Onda de crescimento folicular 🡪 Aumento do Hormônio Folículo Estimulante (FSH) 🡪 Recrutamento folicular 🡪  Seleção 🡪  Dominância 🡪 Folículo Dominante (FD) 🡪 Progesterona (P4) baixa nesse momento (ausência de Corpo Lúteo (CL) ativo) e aumento do Estradiol (E2) levando ao pico do Hormônio Luteinizante (LH) 🡪  Ovulação do oócito em metáfise II (maduro para ser fecundado).

Esquema do ciclo estral das fêmeas bovinas, evidenciando as ondas foliculares e comportamento e ação dos hormônios até a ovulação. Fonte: Genética y Biotecnologías Reproductivas

Sabendo então o oócito maduro (em metáfise II), ou seja, pronto para ser fecundado é o oócito ovulado durante um ciclo estral natural da vaca e que quando realizamos a produção in vitro de embriões estamos coletando o oócito antes dessa fase, ou seja, aspiramos os oócitos ainda em desenvolvimento, teremos ele imaturos para a fecundação, tornando necessário então uma fase onde esses oócitos serão maturados e estarão prontos para receber a fecundação. 

Quais as etapas da produção in vitro de embriões?

Quanto as etapas que constituem a PIVE, podemos citar:

1. Colheita de oócitos;
2. Maturação in vitro (MIV);
3. Fecundação in vitro (FIV);
4. Cultivo in vitro (CIV);
5. Criopreservação ou transferência de embriões.

Colheita de oócitos

Essa etapa consiste em recuperar gametas femininos para a manipulação in vitro. A punção folicular guiada por ultrassom (Ovum pick up – OPU) é a forma mais utilizada em fazendas comerciais e para que seja realizada alguns pontos são de grande relevância: 

• É necessário que seja realizada anestesia epidural das vacas que passarão pela punção folicular e também a higienização do reto e da vulva. 
• Mão introduzida no reto 🡪 Traciona o ovário o mais próximo da cérvix 🡪 Com o auxílio da probe do ultrassom é possível observar os folículos a serem aspirados. 
• Acoplado ao madril, tem-se a agulha que fará a punção. Essa agulha estará acoplada a um sistema de bomba a vácuo que permite que o material puncionado caia dentro de um tubo. 
• Não é necessário o uso de hormônios para a recuperação dos oócitos, mas para ter mais sucesso com a aspiração folicular pode-se aplicar um protocolo de superovulação nas vacas, sendo assim opcional.
• Aspira-se cerca de 20 oócitos de cada vaca, tendo 8 oócitos viáveis em média.

Imagem ilustrando a aspiração folicular guiada por ultrassom. Fonte: Renata Lançoni

Maturação in vitro (MIV)

Sabemos que os oócitos coletados ainda são imaturos, o que confere a necessidade de passarem por uma seleção em microscópio a fim de eleger os oócitos viáveis, para que, por fim eles sejam maturados (etapa de maturação in vitro) e entrem em metáfise II.

Essa etapa de seleção dos oócitos de boa qualidade é essencial para a PIVE e nela haverá a classificação dos mesmos a partir da avaliação do Complexo Cumulus-Oócito (COC), onde podem receber as seguintes classificações: 

• Oócitos grau I = 3 ou mais camadas de células do cumulus, citoplasma homogêneo. 
• Oócitos grau II = 2 ou mais camadas de células do cumulus, citoplasma homogêneo. 
• Oócitos grau III = camada incompleta de células do cumulus, citoplasma homogêneo ou heterogêneo. 
• Oócitos grau IV = degenerado, desnudo (sem células do cumulus)🡪 se utilizar esse oócito estará prejudicando a maturação e posteriormente o desenvolvimento embrionário.

Visualização morfológica de oócitos em diferentes graus. Fonte: Adaptado de Oliveira, 2014.

Nessa seleção, a prioridade sempre será deter de oócitos nas classificações grau I e grau II. 

Meio de maturação = Os oócitos selecionados seguem então para a etapa de maturação, onde é necessário ter um meio de maturação comercial, que recebe adição de antibióticos para evitar contaminações, soro fetal bovino/albumina e hormônios (LH e FSH). 

A maturação tem duração de 18 a 24 horas em atmosfera controlada, contendo 5% de CO² em ar e umidade saturada de 38,5°C. Para que ocorra a passagem dos oócitos imaturos para oócitos maduros, alterações no núcleo e citoplasma acontecem, pois teremos a passagem do estágio de prófase I – 4n para a metáfise II – 2n.

É importante ressaltar que não adianta ter só a maturação nuclear e não ocorrer a maturação citoplasmática, ambas devem acontecer em conjunto. Após essas 18-24 horas o Cumulus é expandido, o que mostra que o oócito foi maturado.

Esquema demonstrando a transformação de oócitos imaturos para oócitos maduros.  Fonte: Renata Lançoni

Fecundação in vitro (FIV)

Essa etapa de fecundação consiste em colocar os espermatozoides junto com o oócito. Para isso, os oócitos são lavados em meio FIV e os espermatozoides precisam ser previamente preparados. 

• Para fecundação, normalmente utiliza-se o sêmen criopreservado/convencional, mas o sêmen sexado e o sêmen a fresco também podem ser utilizados.
• Na escolha do sêmen, a utilização do sêmen sexado (capaz de produzir descendentes machos ou fêmeas, ou seja, permite a seleção do sexo na concepção) permite reduzir o tempo para atingir certos objetivos.
• Na maioria dos laboratórios, utiliza-se sêmen congelado/criopreservado para o processo de fecundação in vitro em bovinos. No entanto, após o descongelamento, é necessário selecionar os espermatozoides vivos e capazes de fecundar. Esta seleção é realizada, na maioria das vezes, pela separação em gradiente de Percoll, embora outros sistemas possam ser utilizados como o “swim-up” ou o lavado espermático.

Sobre esse preparo dos espermatozoides até a deposição na gota de FIV:

1. Descongelar o sêmen (37°C/30seg).
2. Submeter o volume da palheta (0,25ml) ao gradiente de Percoll (sêmen|diluidor + espermatozoides). 
3. Gradiente de Percoll 45% e Percoll 90%.  
4. Centrifugação. 
5. Separação dos espermatozoides viáveis dos não viável (mortos.) 
6. Parte superior = diluidor | Percoll 45% = espermatozoides inviáveis (sem motilidade) | Pelets = espermatozoides viáveis (com motilidade). 
7. Lavagem + centrifugação + meio de fecundação. 
8. Ajustar o volume e depositar espermatozoides na gota de FIV em oócitos – Normalmente utiliza 1 milhão de espermatozoide por ml, podendo chegar em até 2 milhões. Quando aumenta muito o número de espermatozoides por ml, aumentamos também a chance de ocorrer polispermia, ou seja, mais de um espermatozoide penetrando no oócito, resultando em um zigoto poliploide e normalmente inviável.

A- Diagrama da base do Swim Up:  Os espermatozoides móveis são separados “nadando” até a superfície do meio de cultura.

B- Esquema da base do Gradiente de Densidade – Percoll:  Os espermatozoides móveis são separados do resto das células por uma diferença de densidade. Após centrifugação em gradientes contínuos e descontínuos, a fração móvel dos espermatozoides fica localizada na parte inferior.

Fonte: Adaptado de In Vitro Buenos Aires

Meio de fecundação = O meio de fecundação que é utilizado nessa fase contém agentes capacitantes, albumina e antibiótico. 

Essa fase de fecundação tem duração de 18 horas também em atmosfera controlada contendo 5% de CO² em ar e umidade saturada a 38,5°C. É nesse período que ocorrerá a capacitação espermática, ou seja, espermatozoides passando por severas mudanças bioquímicas e fisiológicas para se tornarem aptos à fertilização e consigam ultrapassar a barreira de células do Cumulus. 

De fato, a fecundação ocorre quando o espermatozoide atinge a zona pelúcida, digere e toca no citoplasma. É nesse momento que se tem o bloqueio da polispermia, a partir do endurecimento da zona pelúcida. 

Cultivo in vitro (CIV)

Após fecundados, os presumíveis embriões estão prontos para serem cultivados e nessa fase alguns eventos devem acontecer para que por fim tenhamos embriões prontos para serem transferidos ou criopreservados: 

• Retirada do excesso das células do Cumulus dos embriões, o que chamamos de desnuda. 
• Lavagem e colocação em meio de cultivo SOF – criado com base na constituição de fluido do oviduto de bovinos (com ou sem co-cultivo das células do Cumulus). 
• Em cada gota (0,5ml), colocar em média 100 microlitros da solução de cultivo.  
• Alta tensão de oxigênio (20% de oxigênio e 5% de CO2) X baixa tensão de oxigênio (5% de oxigênio – isso é benéfico para os embriões, pois reduz as espécies reativas de oxigênio, produzindo embriões de melhor qualidade, mais claros e com menor acúmulo de lipídeos), entretanto, os embriões de baixa tensão de oxigênio são sensíveis a variações de oxigênio, então se abre muito a estufa para manipular, eles sofrem bastante. 
• Alguns laboratórios realizam o que chamamos de Feeding e avaliação da clivagem no dia 3 de desenvolvimento. Com isso pode renovar o meio, acrescentando meio fresco para dar mais componentes para o embrião – entrando devemos seguir a premissa de menor manipulação nesse embrião em desenvolvimento e sermos críticos quanto esse método.
• Cultivo até o 7º dia de desenvolvimento 🡪  Blastocisto. 
• Blastocisto = momento em que se faz a transferência para as receptoras ou quando faz o congelamento.

Esquema demonstrando que o D0 corresponde ao dia da FIV. No D3 temos a clivagem e no D7 o estágio de blastocisto. Fonte: Renata Lançoni

Período de desenvolvimento inicial → divisão celular → ativação do genoma embrionário (aproximadamente 8 células) → compactação (mórula → mórula compacta) → formação da blastocele (mórula → blastocisto).

No D7 espera-se encontrar o embrião em estádio de blastocisto, com blastocele (cavidade) e massa celular interna. Nesse dia o embrião deve ser transferido para receptora ou criopreservado.

Imagem ilustrando a morfologia do embrião nos diferentes dias após a FIV.  Fonte: Renata Lançoni

Criopreservação ou transferência do embrião

Após cultivados, os embriões em forma de blastocisto são envasados em palhetas e diretamente transferidos à fresco para as receptoras devidamente sincronizadas, ou podem também ser criopreservados (mantidos em nitrogênio líquido) antes de serem transferidos.

Embriões in vitro x in vivo (2019):

• In vivo: 60% do total de embriões produzidos in vivo transferidos foram de embriões criopreservados (240.000 de 400.000 embriões). 
• In vitro: 45% do total de embriões produzidos in vitro transferidos foram de embriões criopreservados (450.000 de 1.000.000 embriões). 

O objetivo da criopreservação de embriões é manter a viabilidade embrionária por longo período em estado de letargia que seja reversível pós-descongelação. 

Vantagens da criopreservação:

1. Aproveitamento dos embriões excedentes. 
2. Aproveitamento de receptoras excedentes. 
3. Facilidade de comércio. 
4. Escolha da data de parto. 
5. Banco de germoplasma. 

Mas quais as vantagens da produção in vitro de embriões?

• Aceleração da disseminação de material genético superior: A PIVE permite que as fazendas reproduzam geneticamente animais superiores por exemplo em termos de produção de leite, eficiência alimentar e resistência a doenças. Ou seja, é possível ter melhor aproveitamento do potencial genético das fêmeas e a redução do intervalo de gerações (idade média dos pais quando nascem os filhos), o que é benéfico quando se pensa em ganho genético anual. 
• Uso eficiente de animais geneticamente superiores: Animais geneticamente superiores podem ser selecionados como doadores, o que permite termos um número significativo de descendentes advindos desses animais, o que otimiza o uso eficiente de animais de alto valor genético. 
• Aumento na taxa de multiplicação: Possibilidade de produção de múltiplos embriões a partir de um único animal doador, o que amplia a taxa de multiplicação genética. 
• Aprimoramento da eficiência reprodutiva: A PIVE é uma ferramenta útil em casos de dificuldades reprodutivas em animais ou quando se tem o desejo de maximizar o uso de fêmeas com alto valor genético, mas que podem ter limitações reprodutivas naturais. 
• Melhora na produção de leite e eficiência alimentar: Ao selecionar animais com características genéticas associadas a uma produção de leite mais eficiente e uma melhor eficiência alimentar, a PIVE contribui para aprimorar o desempenho produtivo do rebanho. 

Considerações finais

Em resumo, a produção in vitro de embriões em vacas leiteiras é uma tecnologia que desempenha um papel crucial na otimização do potencial genético dos rebanhos, permitindo a reprodução seletiva de características desejáveis e a produção eficiente de descentes de animais geneticamente superiores. Isso, por sua vez impacta positivamente na produtividade, qualidade e sustentabilidade da produção leiteira.

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